ELISA法测定单克隆抗体的效价 – 实验方法

一、实验挥向

1、深化认识ELISA 法尺度抗体效价的规律。

2、征服ELISA 法尺度单克隆抗体效价的办法。

二、实验规律

ELISA以免疫的反响该根底,将反日、抗体的特征反响与酶对底物的高效催化功能相结合起来的一种感光性很高的实验技术。免疫的酶技术是将酶使佩带像章在抗体/反日mol上。,酶使佩带像章抗体/酶使佩带像章反日的状态,酶缀合物。酶偶联物在免疫的反响后的酶,基材对色的碰撞,原因色和吃水,反日定量抗体状态。ELISA是一种免疫的酶技术,它的奇形怪状是申请表格聚苯乙烯微孔板(或球体)用于ADSO。,使它巩固,免疫的反响和酶促反响都在带着停止。每回反响后反复洗濯,这抵押权了反响的定量相干。,还忍住了免税的抗体/反日断裂进展。。ELISA法。酶反响正是一次,反日、抗体的免疫的应对可以一次或屡次停止。,可以申请表格两种抗(抗抗体)。、三抗免疫的应对。

眼前经用的几种ELISA办法有::间接的法尺度抗体,双抗体夹心法和敌对性反日检测法。。本实验采取间接的法尺度单克隆抗体效价。首要迅速移动是:率先,将已知的定量反日吸附在凹孔上。,待测抗体,洗后脱胶胚乳的洗濯,酶使佩带像章抗抗体,绝热后,加法运算基质发热30分钟后,酸碱堵塞酶促反响,用精读或光电现象色度的比色的尺度抗体大量。

三、乐器、主食和反应物

乐器

聚苯乙烯96孔酶规范板、微量吸液管、酶联免疫的细阅仪、水浴锅。

主食

单克隆抗体

反应物

1、反日和酶使佩带像章抗体

①反日:免疫球蛋白 GIgG(免疫球蛋白 GIgG),Code No.A0423);

酶使佩带像章抗抗体:兔抗鼠IgG HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP,Code No.P0260);达科公司个人财产产额,申请表格时,依照说明书停止变稀少。。

4、洗濯液(含吐温20 PBS):吐温-20 500μL加法运算1LPBS。

5、封液(含1%牛血浆白胚乳),%Tween 20的PBS):10mLPBS 中加法运算100mgBSA,10μLTween-20.

6、 底物解决

磷酸钠缓冲溶液(MOL/LPHO6):Na2HPO4,NaH2PO4·2H2O ,用蒸馏水液化,紧握大量为500千分之一升。

(2)TMB储液:60MgTMB液化于10ml二甲亚砜中,4℃避光饲料。

基质申请表格解决:现用现配,磷酸钠缓冲溶液10ml,TNB贮液10μ%H2O2 15μL,混匀。

7、 堵塞液:2mol/LH2SO4

四、手术进展

①反日子宫:免疫球蛋白 GIgG作为反日,申请表格包装液L:8000变稀少,添加100μL /孔聚苯乙烯96孔反响板

中。保存在夜晚4摄氏温度。

②洗濯:次货天凹坑里的气体,洗濯气体3次。

(3)合拢:L00μL封孔液,室温下的房间。

④洗濯:用洗濯气体3次。

添加待测战利品(高音部反):单克DRO细胞培养物上清的浮在表面的:2或1:10),已包装的板上繁殖100μL /孔。,每个战利品一致再版两份。,PBS或空白介质作为阴性的对照,已知范本作为确实的对照。用37℃恒温箱孵育1~2h。

(6)洗濯:用洗濯气体3次。

⑦酶使佩带像章抗抗体:兔抗鼠IgG HRP,封住液L:8000变稀少,100μL /孔,用37℃恒温箱孵育1h。

⑧洗濯:用洗濯液洗5次,蒸馏水2倍。

⑨显色:奇怪的基质解决100μL/孔,室温下5~30min,秀蓝。

⑩堵塞反响、色度的比色的:50μL/孔堵塞解决。色变黄;酶使佩带像章法尺度450nm各孔的吸级数,正反响的最大变稀少度是战利品的滴度。。

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