细胞核中蛋白质介导的DNA空间互作具有重要的生理作用，Hi-C技术凭借其全基因组DNA空间互作解析能力，被广泛应用于染色质高级结构与基因表达调控机制研究中，ChIP-seq则是识别蛋白结合DNA位点的经典技术，将Hi-C数据与ChIP-seq数据联合起来，可以间接推测出目标蛋白介导的DNA空间互作，然而，两种技术的联合也才只是间接推测，因此人们需要某种单一技术通过一次实验就能够直接获得这些信息。
科技的发展，似乎很少让人失望，总是充满了惊喜和期待。将Hi-C与ChIP原理联合起来的ChIA-PET、HiChIP、PLAC-seq等技术相继被开发出来，即先进行Hi-C部分的酶切、补平标记、连接实验，再使用特异性抗体进行ChIP实验，构建出文库进行高通量测序。一些“明星”蛋白如CTCF、Pol II、H3K4me3、H3K27ac等蛋白介导的DNA互作被这些技术在多个物种中被一一解析出来，极大的促进了人们对其参与调控基因表达机制的理解。
然而，几乎没有“完美”的技术，也正是还有缺陷，才促使科技的不断进步。这三个技术所需要的细胞量均很大，少则几十万个细胞，多则上百万千万个细胞，抗体富集均采用的是ChIP策略，实验步骤较繁琐，测序量大，信噪比相对较低。随着CUT&Tag技术的普及，凭借其低细胞量，超高信噪比，测序量少，实验流程简单等优势，正以破竹之势替代ChIP-seq，应用文章数量也逐年攀升。因此，人们很容易想到是否能将Hi-C与CUT&Tag联合起来开发新技术从而优化甚至替代HiChIP等技术。
2022年3月，来自美国宾夕法尼亚大学的研究团队通过将最新的Hi-C 3.0策略与CUT&Tag联合，率先开发出了HiCuT（Hi-C Coupled chromatin cleavage and Tagmentation）技术，其所需的细胞量大幅减少，由百万级别降低至十万个细胞，测序量更是惊人的减少至12 million read pairs即可用于分析，因此极大的降低了测序和分析成本，研究成果以题为“HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions”发表在PLOS Genetics杂志上。
如前所述，HiCuT实验先进行Hi-C部分的酶切、补平、连接实验，再使用特异性抗体进行CUT&Tag实验，构建出文库进行高通量测序。与常规Hi-C实验不同的是，这里所使用的是Hi-C 3.0策略，即双交联+双酶切，但是省去了生物素标记这一步，与同类型技术相比，HiCuT实验流程变简单了很多，缩短了实验时间，减少了细胞需求量，且大幅降低了测序量。
研究者对人的GM12878细胞进行了CTCF和Pol II的HiCuT实验，对人原代角质细胞keratinocytes进行了H3K27ac的HiCuT实验，并与已发表的ChIA-PET、HiChIP、Hi-C数据进行了比较，均得到了较高比例的overlap互作。例如，CTCF的HiChIP得到24910个loops，与Hi-C得到的9448个loops有42%的overlap；HiCuT得到172002个loops，与Hi-C得到的9448个loops有52%的overlap。由于CUT&Tag的靶向精准切割作用，HiCuT数据无需采用HiCCUPS的loop calling流程即可直接得到互作loops，分析方法更为简单。可视化展示的peaks及interactions清晰明了，且能重现出已经被FISH验证过的loop结构。
文章GM12878细胞CTCF的HiCuT实验结果
人原代角质细胞H3K27ac的HiCuT与皮肤炎症GWAS的SNPs联合分析发现潜在致病调控元件
5848vip威尼斯电子游戏的Hi-C数据质量之好，已众所周知（请在“5848vip威尼斯电子游戏”公众号查看更多详细信息以超高数据质量，打造全国“Hi-C建库中心”！），并且一直走在技术革新的前沿（重磅升级丨Hi-C技术发明人Job Dekker发布高精度Hi-C 3.0技术），CUT&Tag产品也已相当成熟（高质量CUT&Tag数据助力高分文章发表），近期转录因子-Flag标签蛋白的CUT&Tag项目文章已见刊一区期刊，详见后期推送。因此，对于我们能轻松掌握HiCUT技能，似乎已在意料之中。的确如此，我们使用小鼠细胞进行了H3K4me3的HiCUT实验，分析结果表明我们的测试数据效果比已发表的文章还要好！
5848vip威尼斯电子游戏小鼠细胞HiCUT (H3K4me3)的peak信息及TSS富集热图
我们仅测序了8Gb的原始数据量，过滤后得到了~12 million read pairs用于call peak，共得到了63682个peaks，从上图可产出，H3K4me3的peak信号在TSS处富集效果很好，可视化结果展示背景噪音很低，好看的peak让人赏心悦目。使用pairtools对Hi-C 3.0部分进行质控，关注大于20kb的远距离顺式互作，我们的比例相比文章中均更高，且如此小的数据量也可以画出较清晰的互作图谱。
5848vip威尼斯电子游戏小鼠细胞HiCUT (H3K4me3)互作热图
从以下peak + interaction的可视化结果来看，HiCUT的peak（第一排）与单独CUT&Tag（第二、三排）的peak重现性非常好，几乎没有背景噪音，而一根根的线条将in peaks中的interactions连接起来（第五排），让我们对peaks间形成的loop结构一目了然！
5848vip威尼斯电子游戏小鼠细胞HiCUT (H3K4me3)的peak及loop互作
由于CUT&Tag中转座酶携带的是illumina的测序接头，因此HiCUT只适用于illumina测序平台，虽然测序量大幅度减少，但我们仍建议稍微多测一些数据量应该会更好。样品制备方面，细胞样品需添加冻存液慢速冻存，组织样品液氮速冻即可。为了达到好的富集效果，抗体仍然是关键，建议选择被ChIP及IF实验验证可用且引用文献较多的抗体。对HiCUT感兴趣或有需求的老师们，欢迎与我们联系合作~
参考文献：
Sati S., et al., HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genet. 2022, 18(3):e1010121.
027-87224696
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