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细胞核中蛋白质介导的DNA空间互作具有重要的生理作用,相关研究成果经常出现在Cell Research、Nature Genetics、Nature Communications等知名学术期刊。以2022年部分成果为例,在扩张型心肌病、黑色素瘤、成人T细胞白血病、血管疾病和前列腺癌等疾病的表观遗传机制研究中,研究人员通常会关注H3K27ac等介导的空间互作,以获得顺式调控元件的高分辨率染色质互作loop,继而解析基因的表达调控。而在细胞发育和分化的研究中,研究人员也会以CTCF、SMC1等蛋白为目标分析相关DNA互作,从而剖析相应的染色质构象变化。
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部分蛋白质介导的DNA空间互作研究
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// 捕获蛋白质介导的DNA互作的方法
研究蛋白质介导的DNA空间互作,常规方法是联合Hi-C和CUT&Tag/ChIP-seq,其中Hi-C解析全基因组DNA空间互作,CUT&Tag/ChIP-seq识别蛋白结合的DNA位点,结合起来即可间接推测出目标蛋白介导的DNA空间互作。进阶方法是“双剑”合并,利用囊括两种信息的一种技术,例如ChIA-PET、HiChIP、PLAC-seq和HiCuT,一次性获得目标“peaks+interactions”信息。
在上述方法中,HiCuT(Hi-C Coupled chromatin cleavage and Tagmentation)是将Hi-C 3.0策略和CUT&Tag联合用于获得蛋白介导的DNA空间互作信息的创新技术。研究表明,在同类型技术之中,HiCuT相对缩短了实验时间,减少了细胞需求量,并且大幅降低了测序量要求。
捕获蛋白质介导的DNA互作的方法比较
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// HiCuT实验
在HiCuT实验中,首先参考Hi-C 3.0策略,对样本进行双交联、双酶切、补平和连接。
对样本进行交联时,使用可以交联到不同空间距离的两种试剂,相对单交联而言,双交联可以固定更多的互作;
裂解细胞后,使用两种四碱基酶进行酶切,双交联和双酶切处理能兼顾获得近距离和远距离的空间互作;
酶切后将黏性末端补为平末端,不添加生物素可以获得更多的DNA满足上机测序并降低PCR冗余;
利用DNA连接酶连接平末端,生成嵌合DNA片段。
之后则按照CUT&Tag步骤进行后续实验,包括ConA beads结合细胞、孵育一抗、二抗、pA/G-Tn5融合蛋白、转座、解交联、回收DNA并扩增,构建完成HiCuT文库。
HiCuT实验步骤
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// HiCuT数据分析
由于采用了Hi-C和CUT&Tag实验策略,因此HiCuT数据质控会同时关注顺反互作及不同距离的顺式互作比例、TSS富集效果、Peaks数量等。数据分析中,分析蛋白介导的DNA互作,重点是关注anchor两端均有peak的loop。首先通过将anchor上的peak注释到相应promoter上,将loop进行分类,包括promoter-promoter和promoter-other等loop,获得调控元件参与的互作。然后对相关基因进行GO/KEGG富集分析,研究基因参与的功能,还可以对loop上的peak序列进行Motif扫描及富集分析,鉴定潜在的参与互作的转录因子等调控蛋白。
HiCuT数据分析内容
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// 5848vip威尼斯电子游戏HiCuT项目经验
如下图所示,在组蛋白(H3K4me3)和染色质结构蛋白(CTCF)HiCuT实验的蛋白介导互作reads中,5848vip威尼斯电子游戏的HiCuT实验数据与文章的结果不相上下,并且在某些数据上,例如距离不短于20kb的顺式互作比例,5848vip威尼斯电子游戏的结果表现得更好。
对CTCF和H3K4me3 相关peak和loop进行可视化,“peaks+interactions”均一目了然。
5848vip威尼斯电子游戏HiCuT (CTCF、H3K4me3)的peak及loop互作可视化
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// 常见Q&A
选择HiCuT实验的一抗时有什么需要注意的要点呢?
答:为了达到好的富集效果,一抗是HiCuT实验的关键,建议选择被ChIP及IF实验验证可用且引用文献较多的抗体。
小 结
作为Hi-C和CUT&Tag技术的合体版,HiCuT技术相对于同类技术减少了对样本量的需求量,可获得高分辨率的空间互作,且极大降低了测序深度。使用HiCuT研究蛋白介导的DNA互作,联合ATAC-seq和RNA-seq,或GWAS风险位点等多组学信息,可以深入解析基因表达的表观调控机制。
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