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        一直以来，ChIP-seq是研究组蛋白修饰和转录因子在基因组上结合位置的有效技术手段，然而，由于其通常需要百万级别的细胞量，且需要经过甲醛交联、超声物理性打断等步骤，使得实验过程较复杂，数据背景噪音高且可重复性较差，限制了数据结果的准确性和稀少样品的可应用性。很多科研人员会为自己的样品做不了ChIP-seq或者即使做了但数据质量不好而沮丧！！！

        但是2019年的夏天注定不平凡，因为5848vip威尼斯电子游戏将为您提供更加先进、简便、可靠的CUT系列技术——可以取代传统ChIP-seq的革命性新技术。

CUT系列技术的前世今生

        ——2017年1月，来自美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队，使用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）MNase进行染色质切割替代ChIP-seq中的超声打断，开发了CUT&RUN技术，文章发表在Elife [1]。

        ——2018年4月，Steven Henikoff团队对之前的CUT&RUN稍加改进，使用digitonin对细胞膜进行“打孔”从而可以无需提前分离细胞核，并将CUT&RUN的详细实验步骤发表在Nature protocols [2]。之后，他们继续对CUT&RUN进行改进，包括使用融合的Protein A与G可以增加与抗体结合的通用性，文章于2019年6月发表在Elife [3]。

        ——2019年4月，Steven Henikoff团队为了简化文库构建过程，使用带有接头的Tn5转座酶替代MNase，从而使得回收后的DNA就已经带有测序接头，开发了CUT&Tag技术，文章发表在Nature Communication [4]。

        这一系列CUT技术极大的简化了ChIP-seq的流程，能够获得分辨率更高、背景噪声更低、可重复性更好的结果。接下来一起看看染色质到底是如何被“RUN”和“Tag”的。

干货中的干货CUT&RUN实操

CUT&RUN（Cleavage under targets and release using nuclease）

        CUT&RUN实验主要步骤如下：

        （1）利用连有刀豆蛋白A的磁珠（concanavalin A-coated magnetic beads）结合细胞（刀豆蛋白A能与细胞膜上的糖蛋白结合）；

        （2）使用非离子去污剂洋地黄皂苷(digitonin)使细胞膜通透，加入靶蛋白的抗体进行孵育（抗体能够通过细胞膜、核孔进入细胞核与靶蛋白结合，可加入二抗增强靶向结合能力）；

        （3）加入Protein A-MNase（pA-MN）进行孵育（Protein A来自金黄色葡萄球菌的表面蛋白，可与抗体的Fc区（恒定区）特异性结合，也可换为pG-MN，还可换为pAG-MN）；

        （4）通过Protein A和抗体的结合将MNase带到靶蛋白附近，通过添加Ca2+启动MNase消化靶蛋白附近的序列，使靶蛋白和其结合的DNA序列从染色质上脱离下来并游离到细胞外；

        （5）此时细胞仍被磁珠吸附，且处于未被破坏的相对完整状态，回收上清中的DNA进行二代建库即可用于高通量测序。

CUT&RUN实验主要步骤流程图[2]

        由于未对细胞核和染色质进行物理性的破坏，整个操作过程相当“温和”，因此CUT&RUN得到的背景噪音数据非常少，测序量相比ChIP-seq大幅减少，却可以得到比ChIP-seq更好的结果。此外，对起始细胞量的要求也大幅减少，针对组蛋白，可低至100个细胞；针对转录因子，可低至1000个细胞，而数据质量都很好且不同细胞起始量的结果也较稳定。简直堪称科研界的“神技”。

不同细胞量（100~6000 cells）的CUT&RUN结果与ENCODE的对比（human K562 H3K27me3）[2]

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）

        由于CUT&RUN中使用的是MNase进行的酶切，回收DNA后需要添加接头构建二代文库，为了简化文库构建过程，将本身带有接头的Tn5转座酶取代MNase，即可更方便的完成文库构建，其它操作条件基本不变（Tn5转座酶由Mg2+激活），这种方法即为CUT&Tag。

CUT&Tag实验主要步骤流程图[4]

        CUT&Tag的数据背景噪音更小，与CUT&RUN相比，结果有很好的重现性，而且其所需的测序量可进一步减少。此外，还可使用微孔芯片和添加组合barcode等，进一步扩展进行单细胞CUT&Tag分析。

CUT&Tag、CUT&RUN的peaks鉴定结果与ChIP-seq的对比（human K562 H3K27me3）[4]

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[Hi-C + ATAC-seq + CUT&Tag（RUN）+ RNA-seq ]+[ 3C/4C + FISH]

ChIP-seq、CUT&RUN、CUT&Tag产品比较

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        参考文献：

        [1]Skene PJ and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife, 2017.

        [2]Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols, 2018.

        [3]Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife, 2019.

        [4]Kaya-Okur HS, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communication, 2019.

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